Biokatalytische Kaskaden ermöglichen die Herstellung des makrozyklischen Peptids Enlicitide

Der in der Erprobung befindliche orale PCSK9-Inhibitor von MSD, Enlicitide Decanoat (MK-0616), ist der erste orale makrozyklische Peptid-PCSK9-Inhibitor, der eine erhebliche LDL-C-Senkung beim Menschen nachweisen konnte. Enlicitide wurde aus einem mRNA-Anzeigebildschirm aus monozyklischen Peptiden entwickelt und anschließend durch nichtpeptidische Vernetzungen stabilisiert, um eine Struktur aus drei fusionierten Makrozyklen zu erzeugen. Dieses komplexe Octapeptid enthält sechs unnatürliche und zwei proteinogene Aminosäuren, die durch 12 Amidbindungen und einen zentralen Kettenverbinder mit sechs Kohlenstoffatomen verbunden sind. Die herkömmliche chemische Synthese erfordert 43 Schritte, Schutzgruppenmanipulationen (fast die Hälfte der Syntheseschritte), chromatographische Reinigungen und einen stark verdünnten Ruthenium-katalysierten Ringschlussmetatheseschritt, was die Skalierbarkeit und Nachhaltigkeit einschränkt.

Entwicklung der chemoenzymatischen Herstellung

Die MSD-Wissenschaftler entwickelten einen präzisen und konvergenten chemoenzymatischen Prozess zur Herstellung von Enlicitide-Decanoat (1), der durch die direkte Kopplung von Monomeren durch Aminosäureligasen in Kombination mit biokatalytischer Peptidfragmentligation und Makrocyclisierungen unter Verwendung von Esterasen und Iminreduktasen ermöglicht wird.

Wichtigste Erfolge

Drei-Enzym-Kaskadenaufbau unter Verwendung von ATP-Grasp-Ligasen

- Eine Drei-Enzym-Kaskade (zwei konstruierte ATP-Graph-Ligasen + ATP-Recycling) baut ein Tetrapeptid aus ungeschützten Aminosäuren zusammen. ATP-Grasp-Ligasen (insbesondere ATP-abhängige Aminosäureligasen, AALs) sind Enzyme, die die Bildung von Amidbindungen zwischen ungeschützten Aminosäuren oder Peptiden katalysieren und dabei ATP als Energiequelle nutzen. Ihr Mechanismus verläuft über ein gemischtes Anhydrid-Zwischenprodukt, das eine direkte Kopplung ermöglicht, ohne dass Schutzgruppen am nukleophilen Amin oder aktivierten Acyldonoren erforderlich sind. In dieser Studie verwendeten die Forscher eine ATP-Grasp-Ligase aus Bifidobacterium jugendlichis (BaAAL) und manipulierte Varianten (Trp-BaAALEng und Phe-BaAALEng), um ein Dipeptid in einer Eintopfkaskade selektiv mit zwei nicht-natürlichen Aminosäuren (Tryptophan und Phenylalanin-Analoga) zu verlängern. Diese Ligasen verfügen über eine schmale, verborgene Elektrophilentasche, die einzelne Aminosäuren als Elektrophile (C-terminale Substrate) akzeptiert, aber auch längere Peptide als N-Nukleophile aufnehmen kann. Diese Selektivität macht sie ideal für den sequentiellen, schutzgruppenfreien Peptidaufbau vom C-Terminus zum N-Terminus. Das verbrauchte ATP wird mithilfe einer Polyphosphatkinase (FbPPKWT) mit kostengünstigem Hexametaphosphat als Phosphatspender recycelt.

Regioselektive Makrolactamisierung durch künstliche Esterase (RsEstEng).

- Konstruierte Esterase (RsEstEng) katalysiert die regioselektive Makrolactamisierung zur Bildung des Northern-Fragments (73 % Ausbeute, 52-kg-Maßstab). RsEstEng wird von einer Wildtyp-Carboxylesterase (RsEst) abgeleitet, die aus Roseibacillus sp. identifiziert wurde. Seine natürliche Funktion ist die Hydrolyse von Esterbindungen. Durch gerichtete Evolution wandelten die Forscher es in einen Katalysator für die regioselektive Makrolactamisierung – die Bildung einer makrozyklischen Amidbindung – bei der Synthese des Northern-Fragments (4) von Enlicitid um. Es akzeptiert den stabilen, sperrigen tert-Butylester des linearen Tetrapeptids (9) als Acyldonor, um das makrozyklische Peptid (4) zu erzeugen und eine intramolekulare Amidbindung zu bilden. Es erreichte eine selektive Cyclisierung ohne nachweisbare Oligomere und nur 0,8 % Esterhydrolyse-Nebenprodukt, selbst unter den Bedingungen hoher Ionenstärke der vorherigen Enzymkaskade.

Konstruierte intermolekulare Thioesterase (BlTEEng)-Ligation

- Die konstruierte Thioesterase (BlTEEng) führt eine intermolekulare Ligation von nördlichen (4) und östlichen Fragmenten (3) ohne Epimerisierung durch. BlTEEng ist eine modifizierte Version einer Thioesterase (TE)-Domäne, die ursprünglich aus der nichtribosomalen Peptidsynthetase (NRPS) von Brevibacillus laterosporus (BlTE) herausgeschnitten wurde. Wildtyp-Thioesterasen in NRPS-Systemen katalysieren typischerweise die Makrocyclisierung oder die Freisetzung linearer Peptide von einem Trägerprotein über eine Thioesterbindung. Die manipulierten Varianten von BlTE zeigten eine gewisse Aktivität, begünstigten jedoch dimere Nebenprodukte. Durch die Enzymtechnik wurde das Enzym so verlagert, dass es die intermolekulare Ligation unter Verwendung stabilerer Isopropyloxoester anstelle der natürlichen, hydrolyselabilen Thioester katalysiert.

Vier-Enzym-Kaskaden-Makrocyclisierung mit reduktiver Aminierung

- Vier-Enzym-Kaskade (PsIREDEng, KsKREDEng und Cofaktor-Recycling-Enzyme StLDHWT, TvADHWT) erreicht eine reduktive Aminierungsmakrocyclisierung zur Bildung eines bicyclischen Diamins (69 % Ausbeute, 46-kg-Maßstab). KsKREDEng ist eine manipulierte Ketoreduktase aus Kyrpidia sp. Es katalysiert die Oxidation einer Benzylalkoholverbindung (10) zu einem transienten Aldehyd (11), abhängig von NAD+. PsIRED ist eine Iminreduktase aus Pseudogymnoascus sp. Es ist NADPHabhängig. PsIREDEng katalysiert die reduktive Aminierung des Aldehyds (11) und des vorhandenen Amins unter Bildung des zyklischen Imins (12), gefolgt von der Reduktion zum sekundären Amin-Makrozyklus (13). StLDHWT regeneriert NAD+ für den oxidativen Schritt, indem es Pyruvat zu Laktat reduziert, während TvADHWT NADPH für den reduktiven Schritt regeneriert, indem es Isopropanol zu Aceton oxidiert.

Abschließende Makrocyclisierung mittels manipulierter PBP-Thioesterase

- Durch die chemische Kopplung mit dem Western-Fragment (2), gefolgt von der manipulierten Penicillin-bindenden Proteinthioesterase (SsPBP-TEEng), wird der endgültige Makrozyklus bei hoher Konzentration (70 g/L) geschlossen – wodurch die typische Verdünnungsbeschränkung (5 g/L in der traditionellen Synthese) überwunden wird. Der Gesamtprozess umfasst drei Kaskadenschritte, 7 manipulierte + 3 Hilfsenzyme, 39 % Gesamtausbeute, Demonstration im Multikilogramm-Maßstab, >99 % Reinheit, keine Chromatographie und keine Schutzgruppen. Diese Arbeit liefert einen nachhaltigen, skalierbaren Plan für die Herstellung komplexer makrozyklischer Peptide, der die Anzahl der Schritte und den Abfall drastisch reduziert und gleichzeitig die Effizienz und den Patientenzugang verbessert.