01 F&E-Hintergrund und Herausforderungen
1.1 Der Hintergrund der Arzneimittelentwicklung von MK-0616
Enlicitide Decanoate (auch bekannt als MK-0616) ist der erste vollständig de novo entwickelte orale makrozyklische Peptid-PCSK9-Inhibitor zur Senkung des Low-Density-Lipoprotein-Cholesterins (LDL-C) und zur Behandlung atherosklerotischer Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Zu den klassischen Beispielen in diesem Bereich gehören, wie in der Abbildung oben dargestellt, neben MK-0616 auch das Antibiotikum Vancomycin (2), das Chemotherapeutikum Paclitaxel (3) und das Krebsmedikament Eribulin (4). Die komplexen Strukturen der Verbindungen 2 und 3 bedeuten, dass ihre eigentliche Synthese immer noch auf halbsynthetischen Methoden basiert, die auf Naturstoffen basieren; Im Gegensatz dazu erreichte das Eisai-Team die Totalsynthese von Verbindung 4 in mehr als 60 Schritten und markierte damit einen Meilenstein in der Synthese von Polyketidverbindungen.
Die chemische Struktur von MK-0616 ist höchst einzigartig: Es ist das erste Molekül, das vollständig von Grund auf neu entwickelt wurde (anstatt aus natürlichen Quellen gewonnen zu werden); Darüber hinaus wird sein weltweiter Bedarf als täglich oral einzunehmender PCSK9-Inhibitor, der für die Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und nicht für onkologische oder antiinfektiöse Anwendungen gedacht ist, die Nachfrage nach herkömmlichen innovativen Arzneimitteln bei weitem übersteigen und eine Produktion in einer Größenordnung von Hunderten von Kilogramm bis zu mehreren Tonnen erforderlich machen.
1.2 Synthetische Herausforderungen und Strategien
Die molekulare Komplexität von MK-0616 stellt hohe Anforderungen an die Prozessentwicklung.
Strukturelle Merkmale: Obwohl MK-0616 von einem makrozyklischen Peptid stammt, das durch Screening mit mRNA-Display-Technologie identifiziert wurde, enthält es 6 nicht-kanonische Aminosäuren (insgesamt 8 Aminosäureeinheiten), einen 37-gliedrigen Makrozyklus, eine Ammoniumsalz-Seitenkette (10) und ein Nicht-Peptid-Fragment (13), was herkömmliche Festphasen-Peptidsynthesetechniken völlig wirkungslos macht, wie unten dargestellt.
Die zentralen Herausforderungen, die es zu bewältigen gilt
1、Die Stabilität polarer Zwischenprodukte (insbesondere für Ammoniumsalzfragmente, bei denen das Gegenion während des gesamten Prozesses kontrolliert werden muss)；
2、Die Selektivität des großen Ringschlusses (erfordert eine Optimierung der Montagereihenfolge zwischen 10 Blöcken)；
3、Herausforderungen beim Scale-up (chromatographische Reinigung vermeiden; Durchsatz im Milligramm- bis Kilogramm-Maßstab sicherstellen)；
daher, Die von den Forschern vorgeschlagene Schlüsselentscheidung lautet wie folgt：
1、Teile und herrsche：Priorisieren Sie die Konstruktion des „Nordfragments“ (ein 17-gliedriger Ring bestehend aus nichtkanonischen Aminosäuren an den Positionen 5, 6 und 7) und vereinfachen Sie die makrozyklische Spaltungsstrategie durch retrosynthetische Analyse (z. B. durch Auswahl der Amidbindung zwischen den Positionen 5 und 8).
2、Einführung in die terminale Seitenkette：Das polare Ammoniumsalzfragment (10) sollte für den letzten Installationsschritt reserviert werden, um Herausforderungen im Zusammenhang mit der Zwischenreinigung zu vermeiden.
3、Der flexible Einsatz von Säure–Basenneutralisationsreaktionen (RCM)：An den Positionen 7 entsteht eine n-Hexan-verknüpfte Kette–13; Diese Reaktion weist eine ausgezeichnete Orthogonalität auf und kann in mehreren Stufen durchgeführt werden.
Durch diese Reihe von Strategien haben Forscher letztendlich einen skalierbaren Syntheseweg etabliert und damit den Weg für die klinische Bewertung geebnet.02
02 Synthetische Strategie und Optimierung
Durch analytische Studien führten die Forscher eine mehrstufige Optimierung des makrozyklischen Schlüsselfragments (Nordfragment) über mehrere Generationen durch und optimierten den Zusammenbau des Südfragments mit dem Endprodukt.
2.1 Generationenübergreifende Optimierung des Nordsegments:
Erste Generation– 37 Iterationen
Die Synthese nichtkanonischer Aminosäuren (z. B. 3-Hydroxyprolin) weist eine geringe Effizienz auf, da sie auf ineffizienten Cyclisierungsreaktionen beruht—wie die Dieckmann-Kondensation—sowie chirale Auflösung; Darüber hinaus erfordert dieser Prozess mehrere Runden der Schutzgruppenmanipulation und mehrere chromatographische Reinigungen, wie in der Abbildung unten dargestellt.
Alle diese Faktoren begrenzen die groß angelegte Synthese von Zielfragmenten.
Synchronsystem der zweiten Generation
Durch die Biokatalyse gelang ein Durchbruch: Die Einführung der Ketonreduktion (KRED) ermöglichte die hocheffiziente und stereoselektive Reduktion vonβ-Hydroxyester; Darüber hinaus wurde das manipulierte TrpB-Enzym zur Synthese von fluoriertem Tryptophan verwendet, wodurch die Notwendigkeit einer chiralen Auflösung entfällt. Dadurch wurde die Anzahl der Syntheseschritte reduziert und der Einsatz von Schutzgruppen minimiert, wie in der folgenden Abbildung dargestellt.
Dieser Syntheseweg zur Optimierung des Northern-Fragments wurde auch in der klinischen Entwicklung angewendet; Allerdings haben die Möglichkeiten, die sich aus der Strukturstrategie ergeben, einen Bedarf für eine weitere Optimierung des Fragmentsynthesewegs geschaffen.
Erstens stellen die wichtigsten Erkenntnisse zu den drei Zwischenprodukten der Spätkristallisation einen kritischen Punkt für die Reinheitskontrolle dar; Daher ist es wichtig, den Syntheseweg zu modifizieren, um diese drei Zwischenprodukte abzufangen.
Zweitens wird empfohlen, die Cyclotrimerisierung von Olefinen so spät wie möglich während des Syntheseprozesses durchzuführen. Dieser Ansatz basiert auf der Überlegung, dass Rutheniumkatalysatoren die Gesamtkosten der Benzothiuraminproduktion erhöhen können; Durch die Durchführung dieser Reaktion im Endstadium der Syntheseroute können somit die Kosten erheblich gesenkt werden.
Daher hat dies die Optimierung des Ansatzes der dritten Generation erleichtert.
Common-Stepping-System der dritten Generation
Durch enzymatische Hydroxylierung wird L-Prolin mit einer Stereoselektivität von über 99:1 direkt zu 3-Hydroxyprolin oxidiert; Es wurden wichtige Zwischenprodukte identifiziert, beispielsweise die Kristallinität des Benzolsulfonatsalzes, wodurch eine chromatographische Reinigung vermieden werden konnte. Es kam ein modularer Aufbau zum Einsatz, zusammen mit Anpassungen der Aminosäure-Kopplungssequenz und einer Vereinfachung der Schutzgruppenstrategie, wie in der Abbildung unten dargestellt.
Das synthetische MK-0616-Northern-Fragment der dritten Generation unterscheidet sich von den Fragmenten, die in den beiden vorherigen Generationen synthetisiert wurden. Diese Auswahl wurde durch die Identifizierung des kristallinen Pentanoats 91 vorangetrieben, dem der Threonin-Aminosäurerest fehlt (der später während der Synthese eingebaut werden soll). Dieses Salz kann mit hoher Ausbeute und Reinheit isoliert werden und stellt ein äußerst stabiles Zwischenprodukt dar, das während des gesamten Syntheseprozesses als Schlüsselzwischenprodukt gespeichert werden kann.
Durch die Optimierung in der dritten Generation erfordert die Trennung des neu gestalteten Nordfragments (91) nun nur noch 14 Schritte—nur ein Drittel der Anzahl an Schritten, die für die Synthese der ersten Generation erforderlich sind. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass im Protokoll der dritten Generation die längste lineare Sequenz um mehr als die Hälfte reduziert wurde, nämlich von 20 Schritten auf 9 Schritte.
2.2 Optimierung des Südfragments
Erste Generation, bestehend aus 15 Schritten
Ausgehend von Rohstoffen, die in großen Mengen von kommerziellen Lieferanten bezogen werden, stellt der 9-stufige Prozess die längste lineare Abfolge dar, wie in der folgenden Abbildung dargestellt.
Synchronsystem der zweiten Generation
Bei der Synthese der zweiten Generation wurde nicht die Anzahl der Schritte verbessert, sondern vielmehr die Gesamteffizienz und Reinheitskontrolle, wie im folgenden Schema dargestellt. Nach Tausenden von Versuchen wurde ein Southern-Blot-Fragment namens Leelaminsalz (99) identifiziert.
Es wurde zuvor gezeigt, dass die Verwendung dieser beiden Verbindungen als nicht-chirale Lösungsmittel für Carbonsäuren dient; Folglich kann das kristalline Salz (99) überraschenderweise als hochreine Substanz erhalten werden, wodurch die umfangreichen präparativen HPLC-Arbeiten vermieden werden, die in der vorherigen Synthesegeneration erforderlich waren.
2.3 Endmontage des Produkts
Sowohl das Northern-Fragment der ersten Generation als auch das zweite Zwischenprodukt des Southern-Fragments können leicht geschützt werden, um den linearen Vorläufer 61 zu ergeben, wie in der Abbildung unten gezeigt; Allerdings ist die Ausbeute an Cycloolefinmetatheseprodukt sehr gering.
Ungeachtet dessen setzten die Forscher erfolgreich eine andere Sequenz ein und ermöglichten so die erste skalierbare Synthese von MK-0616, wie im folgenden Schema dargestellt.
Die Enaldehydsalze der ersten Generation wurden über einen 63-stufigen Prozess synthetisiert, der mit der Installation von Seitenketten am Molekülkern durch Amidierung mit hoher Ausbeute und anschließender SFC-Reinigung beginnt; Unter diesen Schritten stellt Schritt 28 die längste lineare Sequenz dar.
Die Endproduktkombination der zweiten Generation ist in der folgenden Abbildung dargestellt.
Durch die Optimierung der Wege sowohl für Northern- als auch Southern-Fragmente, die auf das Zielprodukt abzielen, können beide Ansätze flache Fragment-Kristallzwischenprodukte nutzen, um zur Endstufe der Synthese zu gelangen.
Diese Kopplungsreaktion ist ausreichend sauber, um unter Verwendung einer Rohreaktion direkt mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
Insgesamt erfordert der Syntheseweg der zweiten Generation für MK-0616 43 Schritte, von denen 21 Schritte die längste lineare Sequenz darstellen. Diese Sequenz reduziert sowohl die Gesamtzahl der Schritte als auch die Länge der längsten linearen Sequenz im Vergleich zum Prozess der ersten Generation um ein Drittel.
03 Schlüsseltechnologische Innovation
Eine Analyse des gesamten Optimierungsprozesses zeigt mehrere Innovationen in Schlüsseltechnologien, wie zum Beispiel:
1、Biokatalyse-Technologie:Dynamische kinetische Auflösung von KRED; TrpB-Enzym-vermittelte Synthese von Tryptophan-Analoga; direkte Einführung von Hydroxylgruppen über Prolinhydroxylase; usw.
2. Kristallisationsgesteuerte Reinigung: Mehrere Zwischenschritte—wie das Methylsulfonat von Northern-Blot-Fragmenten oder das Leelaminsalz von Southern-Blot-Fragmenten—werden zur Kristallisationsreinigung eingesetzt, wodurch Chromatographiesäulen überflüssig werden.
3. Orthogonale Schutzgruppenstrategie: Flexibler Wechsel zwischen Schutzgruppen wie Boc und Nosyl, um die Selektivität mehrstufiger Reaktionen sicherzustellen.
4. Überlegungen zur grünen Chemie: Reduzierung des Einsatzes von Schwermetallkatalysatoren (z. B. Rutheniumkatalysatoren) und Verlagerung der RCM-Reaktion auf eine spätere Stufe, um die Produktionskosten zu senken.
04 Zusammenfassung und Ausblick
Dieser Artikel demonstriert eine flexible Integration von Biokatalyse und chemischer Synthese, betont gleichzeitig die zentrale Rolle von Kristallisationsprozessen und verfolgt einen modularen Designansatz – und stellt so eine systematische Methodik vor, die von der Laborexploration bis zur Produktion im industriellen Maßstab reicht. Diese Arbeit stellt einen beispielhaften Fall auf dem Gebiet der komplexen molekularen Synthese dar: Die Gesamtzahl der Schritte wurde von 63 im Protokoll der ersten Generation auf 43 im Protokoll der zweiten Generation reduziert, wodurch die Ausbeuten um fast das Tausendfache gesteigert wurden und eine Produktion im Tonnenmaßstab möglich wurde. Während des gesamten Prozesses wird der strategische Schwerpunkt auf den Kristallisationsschritt gelegt, wodurch eine chromatographische Reinigung vermieden wird – ein Merkmal, das es hervorragend für die Produktion im Tonnenmaßstab geeignet macht. Darüber hinaus liefert diese Studie eine technische Vorlage für die Syntheseansätze für andere komplexe makrozyklische Peptide.
